年龄依赖性心血管系统功能障碍和自主神经系统调节失衡是导致老年人心血管疾病高发的主要原因｡越来越多的研究发现,心脏功能的年龄依赖性衰退与微小RNA(microRNA,miRNA)在衰老及其相关疾病发展过程中的改变有关,但目前所鉴定出的功能性 miRNA非常有限｡已有研究报道循环miR-216a在心力衰竭患者中显著上调,并可诱导内皮衰老,但miR-216a是否调节心脏衰老仍不清楚｡果蝇胚胎原位杂交实验表明miR-283(miR-216a在果蝇中的同源物)在神经系统中表达｡由于心脏跳动除受自身起搏调节外,还受来自大脑迷走神经和交感神经的“脑-心”信号轴调节｡脑-心调节的机制基于分层时钟系统发挥作用,主生物钟位于下丘脑视交叉上核(SCN),通过与下丘脑室旁核中自主神经前运动神经元的解剖学连接,将神经递质传递给迷走神经和交感神经,将内源性节律强制执行到心脏和其他器官,在心脏中通过窦房结来调节心率和心律,因此miR-216a可能介导了心脏衰老过程中的脑-心调节｡本研究以果蝇为模型,在确定心脏功能年龄依赖性衰退过程中是否伴随miR-283表达改变的基础上,进一步探究心脏和大脑腹外侧神经元(LNvs,与哺乳动物SCN功能类似)中miR-283对心脏功能的调节作用,并探究运动延缓心脏衰老､改善心脏健康的有益作用是否与运动调节miR-283的表达有关,为心脏衰老相关miRNA的研究以及miRNA响应运动训练发挥心脏衰老的保护作用提供理论依据｡

对10天龄(10d,青年)､30天龄(30d,中年)和50天龄(50d,老年)野生型w1118雌性处女蝇进行检测,以评估年龄依赖性心脏功能衰退,检测指标包括半暴露解剖后用EM-CCD高速摄像机拍摄30s心脏跳动视频,并在SOHA软件中分析心脏功能,包括心率(HR),心动周期(HP),舒张间期(DI)､收缩间期(SI),M-mode 心动图统计心动徐缓(DI>1s)和舒张功能不全(DI<0.06s)的发生率,以量化心律失常的发生;对于攀爬实验的果蝇,每组果蝇正式拍摄前,均进行3次适应性震落-攀爬运动(给予10s攀爬时间),正式拍摄6次,截取第5s的视频图片进行攀爬指数分析｡攀爬指数评定方法为:18cm的攀爬区域由底至上平均分成1至9个区域,区域相应得分为1至9分,计算第5秒时各区域内果蝇只数,得分之和为攀爬指数用来评定果蝇的运动能力和神经肌肉协调水平;并通过rt-qpcr检测mir-283表达水平｡此外,基于gal4-uas二元表达调控系统,将表达红色荧光及mirna海绵的uas-mcherry.mir-283.sponge uas-mir-283sp="" w1118="">mir-283SP)､心脏miR-28敲减组(Hand>mir-283SP)和LNvs miR-283敲减组(Pdf>mir-283SP),收集F1代处女蝇在2d时用Leica体视荧光显微镜进行心脏和大脑LNvs红色荧光信号采集,以检测品系构建是否成功;在10d和30d时进行心脏功能和攀爬能力检测､心肌组织和大脑RT-qPCR检测､用激光共聚焦显微镜拍摄心脏F-actin荧光染色图像以评估心肌纤维结构的变化;进一步地,为探究miR-283是否介导运动对衰老心脏的改善效果,w1118>mir-283SP和Pdf>mir-283SP果蝇从10d开始进行持续3周的规律攀爬运动,连续运动5天,休息2天｡运动装置采用本实验室自主研发的果蝇运动转动装置,运动方式为以垂直地面开始的180°的翻转运动,电机转速为0.91rev/s,翻转后停留时间为5s｡于30d 时进行心脏结构和功能､运动能力及RT-qPCR检测,并且每天记录果蝇的死亡情况,以统计miR-283敲减及运动对寿命的影响｡

1) 在野生型 w1118中,与10d果蝇的心脏功能相比,30d和50d果蝇HR显著降低,主要是DI和SI延长导致的｡此外,30d和50d果蝇心脏跳动表现出更普遍的心动徐缓和舒张功能不全,表明中年和老年果蝇心跳节律紊乱,心律失常发生率增加｡同时30d果蝇攀爬能力降低,全身miR-283表达增加,提示心脏功能的年龄依赖性变化可能与miR-283表达积累有关｡

2) Hand>mir-283SP心肌细胞和副心肌细胞表现出红色荧光,同时10d心肌组织miR-283表达显著降低,表明心肌中miR-283敲低成功,但HR､HP､DI､SI 以及心脏跳动节律变化并不显著,并表现出舒张功能不全降低的良好趋势,表明心脏miR-283敲低与衰老相关的心脏功能衰退无关｡Pdf>mir-283S大脑LNvs神经元显示红色荧光,10d果蝇表现出明显降低的HR,延长的HP和 DI,尤其是心动徐缓发生率的显著增加,与衰老心跳表型一致,还伴随着攀爬能力下降及寿命的缩短｡此外,10d Pdf>mir-283SP果蝇肌原纤维排列紊乱,间隙增多,与30d对照组类似,且心脏和大脑中miR-283表达显著增加,表明LNvs中特异性敲低miR-283导致大脑和心肌中miR-283表达增加,这可能是导致心脏功能衰退的主要原因｡

3)持续3周的耐力运动可显著降低衰老和LNvs中miR-283敲减导致的心脏和大脑miR-283表达积累,并且与年龄匹配的对照组相比,运动组果蝇中具有收缩功能的环状肌原纤维和非收缩性的纵向纤维排列更加紧密,间隙减少;心脏功能结果显示,运动后DI显著降低,心率显著增加,舒张功能不全的发生率趋于正常,并显示出寿命延长的综合有益效果｡

LNvs而非心脏中miR-283特异性敲低,导致年龄相关的DI延长､HR降低及心律失常增加,而大脑和心脏中miR-283表达积累介导了这一调控过程｡青年期开始的耐力运动,显著下调由衰老或LNvs中miR-283敲低导致的miR-283积累,改善心肌纤维结构,有效逆转了延长的DI,降低的HR和增加的心动徐缓发生率｡此外,本研究结果提示衰老或心脏相关疾病的预防和治疗策略应综合考虑中枢神经系统的调节作用｡

参考文献：略

作者：李秋芳 郑澜 王小雅 唐朝 余正闻 平旭 易亲

单位：湖南师范大学

来源：运动生理与生物化学分会专题报告