研究目的
心肌梗死(MI)是世界范围内对人类健康产生威胁的主要疾病之一｡MI后引发特定部位心肌缺血缺氧,心肌细胞会面临大量死亡,同时心肌细胞氧化应激水平异常升高｡由于心肌胶原生成和降解失衡,因此会出现替代性纤维化,导致心肌功能严重受损｡ELA是近年来受关注较多的肾源性细胞因子｡运动训练在促进心梗心脏恢复的过程中发挥重要作用｡另有研究发现,为期4周的有氧运动能够有效降低心梗所致心肌纤维化且有氧运动能显著增加心肌组织和循环血液中的ELA水平,心肌ELA表达上调对受损心脏的康复起到一定的促进作用｡有氧运动改善心梗所致心肌纤维化是否通过ELA介导,以及ELA发挥作用的具体分子机制,尚未完全阐明｡探索减轻心梗心肌纤维化,逆转心梗导致心功能降低的手段和方法及其作用靶标,具有重要理论和现实意义｡因此本文主要探究有氧运动通过激活肾源性ELA,靶向受损心肌组织,减轻心肌纤维化的分子机制,从心肾轴层面为改善心梗纤维化提供新的治疗靶点｡
研究方法
动物实验:雄性8周龄C57BL/6J 野生型小鼠,随机分为假手术组(Sham,S)､假手术+运动组(SE)､心梗组(MI)､心梗+运动组(ME)､心梗+肾特异性ela高表达组(MIA)､心梗+肾特异性ela高表达+运动组(MIAE),心梗+肾特异性ela低表达组(MIS)､心梗+肾特异性ela低表达+运动组(MISE)每组8只｡小鼠心梗手术采用左冠状动脉结扎法制备心梗模型,Sham组只穿线不结扎｡采用ela高表达和低表达AAV病毒肾脏注射进行ELA表达干预,采用小动物跑台进行有氧运动干预,检测 ELA介导有氧运动对心梗心肌纤维化的影响｡运动方案:小鼠手术后恢复一周开始有氧运动训练,第一周进行适应性训练,5m/min,20min,在一周内训练时间和训练速度逐渐提升,达到12m/min,60min/d;随后进行正式训练,12m/min,60min/d,5d/wk,持续4周｡训练结束后次日,采用心动超声检测小鼠心脏功能,心动超声检测结束后即刻,立即开胸摘取心脏､肾脏(剥去肾膜),转移至4%中性多聚甲醛中保存｡用于后续生化与分子生物学指标检测的组织在吸干水分后用锡纸包裹后置于液氮中以保持其生物活性｡采用冰冻切片Masson染色观察心肌纤维化;采用RT-qPCR检测肾脏ela､心肌apj和col1a1/col3a1 mRNA;采用Elisa试剂盒检测血清BNP和cTNT水平;采用Western Blotting检测ELA､APJ､TGFβ1､Smad2/3､p-Smad2/3､MMP2､MMP9､Collagen 1､Collagen 3､Bcl-2､BAX和C-caspase3表达｡细胞实验:采用人胚肾小管上皮细胞(HKC)和乳鼠原代心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs),使用AMPK激动剂(AICAR)干预HKC模拟运动效应,采用AICAR浓度梯度分组检测HKC细胞ELA表达和分泌情况(Control 对照组0μM､100μM､300μM､500μM､700μM､900μM不同浓度AICAR梯度干预组,共6 组)｡使用H2O2处理(100μM,1 h) CFs模拟缺血缺氧环境,ELA重组蛋白(ELA-14,为1μg/ml,12h)和TGFβ-Smad2/3 通路抑制剂(LY364947,3μM,30min)干预CFs,探讨ELA抑制心肌纤维化的分子机制,CFs细胞实验分为为正常对照组､H2O2干预组､H2O2+ ELA-14干预组､H2O2+LY364947干预组､H2O2 + LY364947+ELA-14干预组,共5组｡采用Western Blotting检测细胞水平ELA､APJ､TGFβ1､Smad2/3､p-Smad2/3､MMP2､MMP9､Collagen1､Collagen3､Bcl-2､BAX和C-caspase3等指标;采用TUNEL荧光染色检测凋亡细胞数量｡
研究结果
(1) 有氧运动和肾脏ela内源性干预显著影响心梗心肌ELA表达水平｡
(2) 肾源性ELA在有氧运动改善心梗心功能中发挥重要作用｡
(3) 肾源性ELA介导有氧运动改善心梗小鼠心肌纤维化｡有氧运动刺激肾脏分泌ELA表达上调,抑制MMP2､MMP9､Collagen1和Collagen 3等一系列纤维化相关细胞因子的表达,减轻MI导致的心肌纤维化,进而改善MI心功能｡
(4) 肾源性ELA介导有氧运动改善心梗心肌细胞凋亡｡肾脏可应答有氧运动刺激,分泌ELA经血液循环到达心脏,抑制BAX/Bcl-2和C-caspase3等一系列凋亡相关细胞因子的表达｡
(5) 肾源性 ELA 介导有氧运动调控TGF-β1-Smad2/3信号通路｡
(6) AICAR模拟运动干预刺激HKC产生和分泌ELA,是ELA经循环到达心脏发挥保护效应的前提｡AMPK激动剂AICAR干预显著增加HKC细胞ELA表达和分泌,且与AICAR干预浓度呈剂量依赖关系｡
(7) TGFβ1-Smad2/3通路是ELA抑制心肌纤维化的重要信号通路｡
研究结论
有氧运动显著上调心梗心肌ELA表达,抑制心肌细胞凋亡,减轻心肌纤维化,改善小鼠心功能｡肾脏ela低或高表达可显著削弱或改善心梗心肌损伤,且肾脏ela高表达可促进有氧运动对心梗心脏的保护作用｡表明ELA在有氧运动抑制心梗心肌细胞凋亡并减轻心肌纤维化中发挥重要介导作用｡有氧运动抑制心梗心肌TGF-β1和p-Smad2/3｡肾脏ELA低或高表达可分别上调或下调心梗心肌TGF-β1及p-Smad2/3表达｡原代CFs通过ELA-14干预显著抑制TGFβ1-Smad2/3通路,促进CFs凋亡,降低其纤维化｡表明ELA通过抑制TGFβ1-Smad2/3 通路,介导有氧运动减轻纤维化的作用｡综上所述,肾源性ELA可应答有氧运动刺激,并促进ELA分泌经循环达心脏,抑制TGFβ1-Smad2/3通路,减轻心梗心肌细胞凋亡和心肌纤维化,是有氧运动改善心梗心功能的重要机制之一｡本实验发现以有氧运动方式促进肾源性ELA表达,调节心梗后心肌组织中ELA水平,通过抑制TGFβ1-Smad2/3通路,改善心梗所致心肌纤维化,另外,通过对ela高表达或低表达AAV病毒肾脏注射,内源性干预肾脏ELA的生成和分泌,结合有氧运动干预,进一步验证ELA改善心梗心肌纤维化的机制。
参考文献：略
作者：任无竞 段欣妍 席悦 田振军
单位：陕西师范大学
来源：运动生理与生物化学分会墙报交流
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